기본적 단백질 분리법

세포 내에 존재하는 단백질을 얻기 위해선 첫째로 Cell Lysis로 세포를 부숴야한다.

이는 크게 Freezing & thawing, Detergent(계면 활성제), Mechanical한 방법으로 초음파 등이 있으며, 단백질을 뭉치기 위해선 NH4+를 첨가하거나, 원심분리, 크로마토 그래피를 주로 사용하게 된다.

크로마토그래피는 단백질마다 각각의 크기와 Pi값에 따라 분류되는데, 크게 보자면 buffer에서 부터 시작되고 pump로 빨려나오며, mixer를 통해 단백질과 buffer가 고루 섞이게 되면서 컬럼에 들어간 후, 사용하는 컬럼마다 내려오는 특징을 통해 detector로 검사하며 시간별로 분류하게 되는 fraction collector와 recorder로 연구원이 원하는 결과를 확인하는 것이다.

컬럼은 양매성이란 단백질마다의 Pi값이 다른 것을 이용한 ionic exchange로 사용하는 것이 있는데, Pi가 6.5일때, pH가 7.5일때는 -, pH가 5.0 일땐 +로 Cl- 일때는 6.0이 약염기, 7.0 일때는 강염기로 6.0이 첫번째, 6.5가 두번째, 7.0이 세번째로 검출되는 것을 이용한다.

그리고 NaCl을 통한 양이온으로 6.0일때는 강산, 7.0일때는 약산을 통해, 7.0이 먼저, 6.5가 그 다음, 6.0이 마지막으로 순서대로 나오는 것을 분석하게 되는 것이다.

Size exclusion는 필터처럼 생긴 컬럼에 큰 것이 먼저 떨어지고, 작은 것이 나중에 떨어지는 것을 사용한 방법으로, 주의점으로는 해당 단백질이 mono인지 확인해야 하는 것이다.

20kDa를 하려고 하다가 40kDa를 검출하여 실험에 오류가 있다고 잘못된 판단을 할 수 있기 때문이다.

이 외에도 고압으로 컬럼을 빠르게 용해시키는 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)가 있다.

다른 방법으로는 Riffinity는 단백질 마다의 특이적 결합을 이용한 방법으로 히스티딘 6개, 또는 8개를 붙여 금속 이온과의 배위결합을 유도하며 후에 경쟁액으로 다시 정제를 하는 방식으로 진행된다.

Mass Sepctrometry는 민감하게 미량의 크기를 분석하는 방법으로 대부분의 단백질의 단편 사이즈를 확인할 수 있다.

분석, 확인법으로는 전기영동을 사용한 SDS-PAGE, immunoblot을 사용해 항원 항체 반응으로 단백질을 유도 시키는 웨스턴 블롯, 항원 항체 반응으로 특정 Protein 양을 확인하며 효소를 사용하는 ELISA, 그리고 Size와 Pi 차이값을 통해 2차원적으로 단백질을 확인하는 2-dimensional gel electrophoresis(2-DE)가 있다.

2-dimensional gel electrophoresis의 경우, 단백질 한개를 지목하고 염기 갯수를 통해 컴퓨터로 ...+x+y+z=protein size를 확인하게 된다.