프라이머(Primer) 디자인

프라이머(Primer) 디자인은 원하는 세포의 ORF를 확인한 후, 취하려고 하는 염기서열의 시퀀스를 확인하여 제한효소로 필요한 부분만 취하는 것이다.

참고, 제한효소란 특정 시퀀스를 잘라내는 효소로 Blunt end, Sticky end를 생성하면서 잘라내는데, 5', 3' 방향으로 똑같은 염기서열을 가진다.

이때 보통 NEBcutter를 통해 벡터를 건드리고, 염기를 건드리지 않는 0 cutter를 사용하면 된다.

이후, forward primer는 6mer, 제한효소, ATG(start), 12mer로 구성하며, reverse primer는 12mer, TGA(stop), 제한효소, 6mer로 대부분 들어가며, 6mer이나, 12mer는 해당하는 염기서열에 따라 길이를 달리할 수 있다.

프라이머 디자인에서 가장 중요한 것으로, CG값 농도와, 중복되는 염기서열을 통한 온도 조절이 가장 중요하다.

이 프라이머 디자인의 응용으로 competent cell 제작 후, Heat shock로 Calcium phosphate 방법으로 Transformation으로 외래 DNA을 세포 내에 넣을 수 있게 된다.

참고, competent cell이란, 외부로부터 DNA를 받을 수 있는 상태의 세포를 의미한다.

이를 제작하기 위해서는 E.coli 세포막에 있는 음전하를 바꿔서 음전하인 외부 DNA를 넣을 수 있게 CaCl2로 양이온 처리함으로써 세포막과 DNA의 반발력을 중화시켜 Heat shock로 세포막 내부와 외부의 온도 차이로 DNA가 내부로 들어가게끔 한다.