전사의 메커니즘(Mechanism of Transcription) 총정리

우리 생명체가 단백질로 얻기 위한 정보는 2%(인트론으로 인해)이라 기존의 DNA는 쓸모없는 정보가 매우 많다.

이렇기 때문에 핵에서부터 Intron을 제거하고, Ribosome Complex로부터 핵에서 단백질 생성을 방지하기를 보호하게 된다.

Transcription 구성요소의 경우, RNA Polymerase, T/C Factors, -NTPs(ATP, CTP, GTP, UTP), 그리고 기타 등등이 있다.

(참고로, Translation은 mRNA, tRNA, Ribosome(Protein rRNA)이 존재한다.)

이들은 2%에 있는 TATA Box를 찾게 된다.

특징으로 RNA를 사용하며, 특정서열에만 개시하기 때문에 프라이머가 필요없다.

이들은 짧은 시간에 단일 유전자로부터 다수의 전사물을 얻어야하며, 복제보단 정확도가 떨어진다.(1/10^4, 1/10^7에 한번씩 Mutation)

또한 복제는 DNA 분지에 유전정보를 동일하게 저장하지만, 전사는 특정 부분만 선택하게 된다.

RNA Pol은 원핵생물의 경우 1개, 진핵생물의 경우 3개를 가지며 Core Enzyme이 유사하여 비슷하게 생겼다.

진핵생물의 경우 5가지의 Pol을 가지고 있다.

Pol 1	pre-rRNA 전구체 유전자 전사
Pol 2	모든 단백질 유전자 전사(mRNA) 담당
Pol 3	특수 유전자(tRNA, snRNA, 5s rRNA
Pol 4&5	(식물에서만 발견) 2개 DNA 의존적 RNA Pol(SiRNA), 전사 침묵(Transcriptional Silencing)

RNA Pol 의 경우, 야구 글러브 모양으로, DNA가 들어가며 이 곳에 Active Center Cleft를 가지고 있으며 내부에선 DNA substrate들과 만나며, 외부에선 Protein 들과 Interaction을 하고, 5개의 Subunit들이 Metal ion을 촉매시킨다.

개시(Initiation)은 3번의 과정을 거쳐 진행된다.

첫번째, Closed Complex를 형성한다.

이 후, Promoter와 Polymerase가 결합하고 DNA와 Pol이 한쪽에 결합한다.

두번째, Open Complex를 형성하며 3' 말단에 새 Ribonucleotide를 첨가한다.

이 후, DNA Strand를 분리하고 Transcription Bubble을 형성하고 이는 single DNA Strand이다.

세번째, Promoter Escape를 하며 이는 Initial Transcribing Complex 후 Abortive Transcription이 진행된다.

이 후, Template Strand에 RNA Strand (~10nm 사이즈)를 형성하고 효율 낮은 반응으로 짧은 RNA를 형성 후 중합효소-프로모터 복합체로 초기 전사 복합체로 일하게 된다.

그 다음 RNA exit Channel을 통해 10nm 이상 RNA를 생성한 후, Enzyme, DNA, RNA의 안정한 Complex가 생성되고 Elongation Phase로 진행하게 된다.

Elongation은 RNA Pol이 짧은 10개 RNA를 생성 후 시작한다. 이는 프라이머가 없어서 올바른 방향으로 결합되는지를 확인하는 것이다.

DNA를 진행방향으로 풀고 반대 방향에서 다시 결합시키며 합성되는 RNA 가닥을 주형서 분리, 그리고 효소로 고정도 하게 된다.

Termination은 RNA를 DNA로부터 방출하는 것으로, 일부 세포에서 종결 Sequence가 있다.

세균에서의 전사는 원칙적으로 RNA Pol이 어디서든지 전사할 수 있지만, 프로모터에서만 가능하다. 이는 핵심효소(a2bb'w)과 시그마70인자로 완전효소인 Holoenzyme가 되며 진핵에선 Pol2로 진행되기 때문에 안된다.

위 사진은 프로모터의 공통서열이며 이와 비슷할수록 강하며 RNA Pol이 붙기 쉬운 형태이다.

추가요소로써 프로모터에선 -35 부근엔 시그마4라는 것, -10엔 시그마2가 있다.

이들은 만약 -35가 존재하지 않을 시 신장된 -10이 대신 일한다.

또한 만약 -10 아래에 식별자가 있으면 Polymerase Complex Stability가 높아진다.

따라서, Up, -35, -10, 식별자가 모두 있을 시 강하다고 볼 수 있다.

단순하게 중합효소가 프로모터가 있는 경우는 시그마 4가 -35를 인식하며, Helix Turn Helix 구조가 -35의 주홈(Major Groove) 결합을 하며, 시그마 2는 -10을 인식 후 알파 헬릭스에 복잡한 인식을 하게 된다.

시그마 2는 Closed에서 Open으로 전환 시에 DNA 풀링이 일어나는 곳이라 결합 이상으로 복잡한 것이며 SSB와 유사한 풀어진 DNA 안정화를 이루게 된다.

신장된 -10 부위는 시그마 3의 알파 헬릭스가 인지하며, 식별자는 시그마 1, 2가 인지하며 Up 요소는 중합효소의 DNA 결합을 강화시키고 알파 CTD가 알파 NTD와 Linker로 연결되며 결합하게 된다.

Opened Complex 전환은 RNA Pol와 Promoter DNA 구조가 변환된다.

이는 DNA 이중나선이 Template, Non-Template로 분리되며 이는 Melting(-11~+3)에 해당된다.

세균에서 명명은 이성질화(Isomerization)으로 DNA-효소 복합체에서 자발적으로 이뤄진다. (ATP를 사용하지 않는다.)

isomerization은 -10에서 알파 2가 결합해 Single Strand DNA(ssDNA)에서 A-11, T-7가 시그마에 결합해 멜팅이 이뤄진다.

Open Complex에선 5개의 채널이 존재하며, NTP-uptake Channel(+1), RNA exit Channel, Down Stream DNA Channel(집게 사이 +3), NT Channel(Non Template), T Channel(Template, -11 Dobule Helix 담당) 으로 각각의 위치에서 존재한다.

이성질화에서 Open 집게가 Downstream DNA를 강하게 잡으며, 시그마, amino terminal에서 부분 1.1의 위치를 변경한다.

DNA에 결합을 안할 시에는 주형 DNA가 못들어오며 Open Complex에서 효소가 옆으로 이동해 DNA가 들어오게 하며 알파 1.1은 음전하가 된다.

RNA Pol은 프라이머가 없다.

이를 통해 염기가 Active Site에 바른 방향으로 결합하기 힘들다.

T/C 최초 시작점에서 1, 2개 몇개의 Nucleotide에 특별한 Interaction이 필요한데, 이는 보통 A에서 시작하며 이 이유는 DNA 주형의 T와 수소결합이 이뤄진다.

이로써 RNA Pol과 Temp Strand 의 상호작용에서 시그마 3/4 Linker가 중요하다.

전사 초기에는 짧은 RNA를 합성 후 방출하는데 전사체 합성 전에 행동한다.

RNA Pol 3가지 모델로썬 일시적 탈선으로 Pol이 프로모터를 따라 짧게 이동 후 다시 복귀하는 모델, 자벌레식 모델은 pol의 유연한 부위가 이동해 다시 복귀하는 모델, 깨물기(Scrunching) 모델은 정지상태에서 DownStream DNA가 효소쪽으로 당겨져 Loop를 형성하는 모델이 있다.

Promoter의 탈출로 초기 전사과정 중 전사 중단이 발생한다.

10 Nucleotide 이상 RNA 합성 시 Pol이 Promoter와 분리를 하며 Elongation을 시작한다.

긴 RNA는 Active Center Cleft에서 DNA와 결합을 하지 않으며, RNA 탈출 채널로 가게 된다.

이후 Promoter가 Pol과 떠나기 위해선 시그마 Factor를 제거해야하는데, 이는 시그마 3/4 링커가 관여를 하게 된다.

이는 Open Complex에서 RNA exit Channel에 미믹의 형태로 존재하며 깨물기로 물린 DNA가 다시 감기는 힘으로 중합효소-프로모터와 핵심 효소 시그마와 상호작용을 깬다.

따라서 깨물기는 Elongation Phase로 가기 위한 축적 에너지 축적 과정이라 볼 수 있다.

Elongation은 합성된 RNA가 8-9 Nucelotide만 DNA와 Base Pairing 후 RNA exit Channel로 이동한다.

RNA Pol은 고정기능(Proofreading)으로 피로인산 고정(Pyrophosphorolytic editting)을 하는데 이는 효소의 역반응을 통해 활성부위에 ppi를 첨가해 잘못 들어간 리보뉴클레오티드를 제거한다.

가수분해 고정(Hydrolytic Editting)은 합성 방향 반대로 1~2 Base 뒤의 Nucleotide 를 절단해 서열을 제거하며 Gre Factor가 관여하는데 이는 신장 촉진도 가능한데, 이것이 중합효소가 전사가 어려운 서열에서 쉽게 하게끔 한다.

Termination은 T-Seq를 만나면 DNA로 부터 RNA Pol와 RNA로 분리된다.

박테리아는 단백질 Rho-의존성, 비의존성 종결인자가 있다.(Rut site(~40 nucleotide)

의존성은 전사시에 pol에 붙어 RNA로 이동하며, Rho는 번역중인 RNA에는 결합하지 않는다.

비의존성은 짧은 Inverted Repeat(~20정도), A:T pair를 이루며 RNA가 헤어핀 구조로 Elongation Complex 분해하며 A:U에서 약하며 Termination을 유도하게 된다.

진핵세포의 전사는 3종류의 Pol이 있는데 여러 종류 general에 Transcription Factor(GTFs)가 필요하다.

이는 추가적인 Factors가 필요한데 진핵세포의 DNA는 Nucleosome으로 존재해 GTFs론 힘들다.

이로써 DNA-Binding Regulatory Protein과 Mediate-Complex, 그리고 Chromatin-Modifying Enzyme이 필요하다.

Core Promoter의 경우, Pol 2가 정확하게 전사할 시 필요한 최소한의 서열 요소로 이는 40~60개의 뉴클레오티드를 가지고 있으며 전사개시점 근처에 위치하며 Upstream 쪽에 조절 서열도 존재한다.

Preinitiation Complex는 시그마 인자와 비슷한데 Pol의 Promoter와 결합하며 DNA 멜팅과 추가로 Elongation 전환이 이뤄진다.

Pol 2에는 Promoter에 TATA Box가 있는데 이는 TF2 Complex와 결합하며이는 멀티 서브 유닛 Complex로 TBP와 TAFs가 합쳐진 형태로 TATA binding protein과 TBP-Associated factor이다.

박테리와의 다른 것으로 박테리아는 Abortive Initiation 후 Elongation이 진행되는데 진핵세포의 경우 멜팅과는 다른 별도의 ATP 분해로 Polymerase Tail Phosphorylation가 진행된다.

RNA Pol 2의 Large Subunit의 CTP Tail 인산화가 중요한데, 이는 Heptapeptide 반복으로 YSPTSPS로 구성되어 있다.

이는 Kinase(TF2H)에 의해 인산화가 가능하며 Open Complex에서 CDK-7, -9으로 ATP를 사용해서 프로모터를 풀고 제거한다.

Promoter와 결합 시엔 Dephosphorylated Form을 형성해 Tail에 ser+p가 된다.

Tail에 여러 개의 Phosphate가 결합하면 대부분 TFs 및 Promoter로 분리된다.

TBP Binding & DNA distortion은 TBP는 베타 시트로 TATA의 Minor Groove에 결합하는데 일반적으로 알파 헬릭스에 Major Groove 쪽에 결합한다.

이는 Specifity 문제로 TBP 결합후 Minor 쪽에 벌어져서 80도가 구부러짐으로 TATA box의 A:T base Pair이 관여하게 된다.

Elongation RNA Pol은 무조건 히스톤이 관여하게 된다.

이는 FACT(Facilitate Chromatin Transcription) factor로 Chromatin의 Transcription을 촉진하게 된다.

Heterodimer로 spt16, SSRP 1이 H3/H4가 tertramer와 결합한다.

FACT factor는 RNA Pol 2 앞에서 H2A/H2B dimer 하나를 제거하는데 HAT가 관여하게 되며 히스톤 샤페론 기능 보유 RNA Pol 2를 지닌다.

RNA Processing은 5' Capping, Splicing, 3' Polyadenylation이 진행되며, 캡핑은 RNA 5' end에 Methylated 구아닌을 첨가한다.

5' end Phosphate를 제거하며 GMP를 부가하고 Methylation한다, 이 후 RNA Pol에서 나오자마자 Capping이 진행되는데, 이후 Ser S의 Phosphate를 제거한다.(Dephosphorylation)

그 후, Capping machinery를 분리하며 Ser2 Phosphorylation 후 RNA Splicing이 진행된다.

Polyadenylation & Final RNA Processing은 Gene의 끝에 전사 후 Polyadenylation을 유도하는 특정 시퀀스에 의해 진행되는데(Poly A) RNA를 절단한 후 아데닌 Residue를 부가하고 Pol에 남은 RNA를 분해한 다음 전사를 종결하게 된다.

polyadenylate은 CTD Tail에 의해 Polyadenylation Machinery가 동원되는데, Poly-A polymerase가 Template 없이 가능해지며 ATP를 사용하고 RNA Pol과 비슷하게 생겼다.

Pol은 mRNA가 절단된 후에도 전사를 지속하게 되며 별도의 종결 Machinery가 필요하게 된다.

전사 종결은 첫번째, 어뢰 모델(Torpedo Model)이 있는데 이는 특정 단백질에 의해 RNAse activity로 인해 빠르게 분해하며 RNA pol이 밀어내거나 RNA를 당겨 분리 유도하게 되며 이는 Rho 의존 종결과 비슷하다.

두번째, Allosteric Model은 폴리아데닐화와 연관되어 구조 변화를 유도하게 된다.

Pol 1, 2의 전사는 별도의 프로모터와 GTFs가 필요하며 TBP에 의한 개시는 Pol 2와 공유한다.

Pol 1은 rRNA 전구체 Gene에 발현되며 프로모터는 코어 요소와 UCE(Upstream Control Element)가 구성되어 있다.

이는 개시를 위해 2개의 Factor(SL1, UBF)가 필요하며 SL1은 TBP 및 3개의 TAFs와 함께 Core Element를 구성한다.

Pol 2는 프로모터는 다양한데 전사 시작 사이트 하류에 위치하게 된다.

마지막으로 RNA Pol에 붙는 단백질 확인 방법으로는 SDS Page에서 Negative Charge를 걸고 확인하는 방법인데, IP&SDS를 통해 면역 침강과 SDS로 확인할 수 있다.

어떻게 종결되는지 확인 방법으로는 IP로 RNA Pol에 있던 단백질들을 처리후 Complex화 된 것들과 함께 SDS-PAGE로 처리해서 단백질을 확인하면 된다.