RNA Splicing 과정 총정리

RNA 스플라이싱(Splicing)이란, 간단히 말해서 Pre-mRNA에서 mRNA로 가는 것이다.

박테리아는 해당 과정이 필요없는 이유로 Intron이 존재하지 않기 때문에 고등생물인 진핵세포에만 해당된다.

이는 Non-cording(Intron)을 제거하는 것으로 Mature mRNA로 만들기를 위함이다.

첫째로 Pre-mRNA는 인트론과 엑손(Exon)으로 구성된 Mosaic 형태를 갖추고 있다.

이는 RBS(Ribosome Binding Site)-Exon-Intron-Exon-...Stop Terminal 형태로 구성되어 있으며, Intron의 개수는 엑손 개수의 ± 1 정도 차이나며, 인트론이 존재하면 길이가 더 길어져 생체적으로 효율적이진 않다.

하지만, 이 이유는 100%로 구성된 cDNA 처럼 Mature DNA 형태로 구성되어 있다면 Mutation이 쉽기 때문이다.

Alternative Splicing은 서로 다른 Exon 조합이 mRNA로 생성되는 것인데, Gene 90%가 이로 형성된다.

이는 1개의 유전자에서 여러개 폴리펩티드 산물이 될 수 있는데 이는 Isoform으로 다양한 Protein이 될 수 있다.

RNA Edit은 초기 전사체가 변경되는 방법인데, mRNA Seq을 변경하는 것이며 효율적 진화를 보여주는 것으로 원하는 조직에서만 발현된다.

이에 대한 예시로 Apolipoprotein B mRNA가 있으며 이는 간이나 소장에서 발견할 수 있다.

Lariat은 엑손 연결시 올가미 형태를 제거하는 것으로 Intron에서 2번의 Transesterification(트랜스에스테르화)로 5'Splice Site 와 3'Splice Site의 분기점인 A에서 A의 2'OH가 5' Splice site의 G-P를 공격하며 핵친화성기로 작용한다.

이후, 5' exon의 3'-OH가 3' Splice Site 인산기를 공격한다.

이것은 에너지 변화가 없지만, Splicing 반응에서 조합하며 작동시 ATP 사용이 늘어나고(Spliceosome) 역반응이 잘 일어나지 않는데 제거된 Intron을 빠르게 분해함으로 가역반응이지만 Irreversible하다.

이어맞추기 복합체(Spliceosome)은 트랜스에스테르화 반응의 매개자로써 150개의 단백질로 구성되어 있고, 5개 RNA Complex로 구성되어 있따.

snRNA(Small Nuclear RNA)는 5가지 RNA로 구성되어 있으며, U1, U2, U4, U5, U6가 있다.

이들은 Protein과 결합해서 SnRNP(Small Nuclear Ribonuclear Protein)을 형성하고, Splicing Reaction Stage에 따라서 구성 요소가 변화한다.(SNRNP 이외의 Protein들로)

SnRNA는 RNA-RNA, RNA-Protein, Protein-Protein Interaction으로 되며, 첫번째, 5' Splice, SiteBranch Site 인식하고, Site에 결합 후, 마지막으로 Catalze(RNA Cleavage/Joining Reaction)한다.

RNA-RNA Hybrid는 U1의 5'splice site를 인식 후, U6의 재인식이 일어난다.

U2의 BBP로 A 분기점을 인식하고, U2와 U6가 서로 인식하게 되는데 이때, 5'splice site와 분기점은 한 곳으로 몰게 되어 Active site가 구성된다.

Non-SnRNP Protein인 BBP(A인식 단백질)은 U2로 대체되고, Dead Box Helicase Protein은 ATPase를 활성하고, RNA-RNA 상호작용을 분리한 후 재배열이 일어나게 된다.

마지막으로 RNA annealing Factor로 Spliceosome을 분리시키게 된다.

Splice-Assembly는 인트론 이외 다른 Exon으로도 가능하고, 다이나믹하게 다양한 변형을 할 수 있다.

이는 U1 SnRNP가 5'Splice site에 결합 후, U2AF(65)가 BBP 뒤에 U2AF(35), 그 뒤인 3'Splice Site에 결합한다.

py 연속서열(Py tract)가 BBP를 Branch Site로 유도하고 이것이 초기 복합체(Early Complex)이다.

마지막으로 U2 SnRNP가 BBP를 대체하고 A Complex로 Double Strand 구조에서 A Bulge를 형성한다.

Rearragement로 U4, U6 RNP와 U5 RNP가 결합해 Tri-SnRNP Particle에 의해 U1, U2가 집합하며 B Complex를 형성한다.

Catalyze로 U1이 탈락하고 U6가 5' Splice Site에 결합한다.

그 후, U4가 탈락하고 U2:U6 Base Pairing으로 C Complex를 형성한다.

마지막으로 U6와 U2가 Active site을 구성하고, RNA Substrate도 정확한 위치로 이동하게 된다.

이때, 첫번째 Transesterification, 두번째로 U5 snRNP가 2개 Exon들을 모아서 진행하고, snRNP 결합 상태로 분리된 Lariat 형태의 Intron은 분해되고 SnRNP가 재사용된다.

Self-Splcing Intron은 Nuclear Pre-mRNA가 2 Transesterification하는데 특별한 Protein 또는 RNA Molecules 도움 없이 Precursor RNA가 특수한 Conformation으로 접혀 Spliceosome없이 스스로 촉매 역할을 한다.

이는 Ribozyme 반응과 유사하지만, Self-Splicing intron은 한번의 촉매 역할만 한다.

Group 1 Intron은 Branch site A 대신 Free G를 사용하고 이를 통해 5' Splice Site를 공격한다.

이후, Intron 끝에 붙고 Free Exon End가 3' Splice Site를 공격한다.(Transesterification)

이때 Lariat 형태가 아닌 Linear Intron으로 제거된다.

Group 1은 G로, G Binding Pocket에서 Conserved Seconary Structure을 형성한다.

Internal Guide Seq으로 G 뉴클레오타이드 공격이 일어나는 5' Splice Site를 인식하는데 이때 RNA Seq가 중요하다.

이 이유는 intron이 정확히 접혀서 2차 구조를 만들어야 하기 때문이다.

Group 2 Intron은 Spliceosome Mediated Splicing 과 비슷하다.

RNA 촉매기능이 유지되면서 특이적 기능은 snRNP로 대체되어 Pre-mRNA Spliceosome에서 진화된것이다.

이는 Intron Target site를 결정하는 최소 Seq만 필요하며 이를 통해 구조적 다양성이 다양해진다.

Group 2는 A로, Site A가 Exon 끝을 공격(Transesterification, snRNP Complex와 유사)하고, 이후 Lariat 형태 후 Exon 끝이 타 Exon을 공격한다.

초기 생명체가 RNA를 촉매역할로 쓰다가 단백질(Spliceosome)으로 대체한 듯하다.

그러므로 U6를 Region 5로, U2를 Region 6로 하며, snRNP 없이 Pre-mRNA 자체 Folding 이 일어나 2차 구조를 형성하게 된다.

Spliceosome의 Splice Site 찾기는 U1, U6의 확인으로 Active Site를 형성하지만 mRNA의 Error 가능성이 있다.

이때 Exon Skipping과 Pseudo Splice Site Slection로 엉뚱 단백질을 형성할 수 있다.

이는 snRNP로 인지하고, 전사가 동시 진행되어 Exon Skipping을 다운시킬 수 있다.

이는 첫째로, Splice 관련 Protein들은 Polymerase의 Tail(CTD)가 붙어서 Splice Site 형성 시 바로 인식하여 결합하고 그러므로 Exon Skipping이 최소화된다.

두번째, Exon에 포함된 Splice Site 구별 기전으로 SR(Serine Argine-rich) Protein이 Exon 내부에 존재하고 Exonic Splicing Enhancers(ESEs)에 결합한다.

SR은 SR protein은 가까운 Splice site에 Splicing 가구를 충원(U2AF는 3's, U1은 5's)하고 Alternative Splicing에도 필요하다.

Variant Splicing은 5' Splice Site 3'-OH기가 3' Splice Site를 바로 공격하지 않는 이유이다.

Alternative Splicing이 멀리 있는 Exon과 연결을 위한 의도된 Exon Skipping이고, 서로 다른 RNA간 Splicing 으로 Fusion(Trans-Splicing, Suffling)이 진행되는데, 이는 Lariat이 아닌, Y-Shaped Branch Structure 형태로 존재한다.(예시로, C.Elegance는 모든 mRNA에서 Trans-Splicing을 한다.)

Alternative Spliceosome(Minor Spliceosome)의 기능은 같다.

기존 고등 생물은 대부분 pre-mRNA를 Major Spliceosome으로 조절하는데, Minor의 경우 Major U RNPs와 일부 요소가 다르다(U11, U12에서 U1, U2가 같은 기능을 하지만 다른 Seq를 인식하는 것)

Alternative Splicing의 억제법은 hnRNP가 있으며 Alternative Splicing은 다분화능에 영향을 끼치며, 초바리의 성별 선택과 질병을 야기할 수 도 있다.

이는 1개의 Gene에서 Alternative Splicing으로 다른 mRNA와 Protein을 isoform으로 형성할 수 있고, 1개의 Gene에서 2종, 수백, 수천의 mature mRNA를 내보낼 수 있다.

하지만 발생 시에 Alternative Exon은 2가지 Exon Set 중에서 1개만 선택하게 된다.

이들은 Exon Skipping, Exon Extension(일부 Intron이 포함될 수 있음, 이에 대한 예시로 SV40 T-Antigen(1개의 Gene에서 2개 T 단백질을 생성하는 것, 인트론 안에 5' Splice Site 존재함), Intron Retension(엑손처럼 인식하는 것), Alternative Promoter, Alternative poly A site(라이신 다량 존재), Trans-Splicing이 있다.

Mutually Exclusive Splicing(Alternative Exon Selection)은 예시로 알파 트로포닌 T의 엑손 3과 엑손 4가 있다.

이는 첫째로 입체적 방해로 인트론의 Splice Site가 너무 가까워서 배제시키는 것, 두번째로 Major and Minor Spice 조합을 통해 자기들 끼리 인식할 수 있는게 있어서 조합하는 것, 세번째로 종결코돈 생성으로 인한 분해, 2가지  Exon을 모두 포함할 경우 중간에 Non-sense Codon을 생성하는 것이다.

따라서, 1.2.3.4 에서 1.2.4가 될 수 있고 1.3.4도 될 수 있는 것이다.

이에 대한 예시로는 mRNA에서 초파리(Drosophila melanogaster)의 Dscam(Down Syndrome Cell-adhesion molecule)이 있는데 이는 24개의 exon을 가지는데 20개는 항상 같고, 4개로 대체를 형성하는 것으로 12*48*33*2=38016개의 Isoform을 형성할 수 있다.

이는 Exon 6의 48개 가능 구조는 기존 메커니즘으로 설명이 불가능한데, Pre-mRNA내의 선택적 base Pairing으로 된다.

이는 Exon 5, 6 사이의 Docking Site가 존재하고, Selector Sequence로 모든 Exon 6 Variant 앞에 위치한다.(Bioinformatics 분석의 사례)

Splicing Regulation는 SR Protein으로 Activator를 가지고, hnRNP(Heterogeneous)로 RS Domain이 없어서 Splicing을 차단하는 Repressor가 존재한다.

Exon Shuffling은 Intron early Model이 아닌, Intron Late Model이며 진화과정에서 Intron이 추가된 것을 보여준다.

이는 Exon이 재조합으로 뒤섞여 새 단백질을 암호화하는 유전자를 만드는 것이고, 새로운 Gene 생성에 용이하며 Mutant 확률을 낮춘다.

근거로는 Exon/Intron 경계가 Protein의 Domain간에 종종 일치하는 점, 그리고 관계없는 Gene들에서 유사한 Exon이 발견되어 Exon이 다른 단백질에서 재활용된다는 것을 보여준다.

이에 대한 예시로는 (LDL receptor Gene(EGF, C9)와 Chromartin Modifying Enzyme이 있다.

RNA Editing은 Transcription 이후 Base 변형 또는 삽입/탈락 과정이다.

이는 Site-Specific Deamination, 시토신이 유리딘으로 가는 것이고, 특정 세포/조직에서만 발생하고 조절된다.

이에 대한 예시로 ApoB(lipoprotein, 간과 소장에서 Cytidine Deaminase)와 ADAR(Adenosine Deaminase Acting on RNA)로 Adenosine 이후 inosine을 전환, 촉매하는 것으로 이후 mRNA Transport로 끝난 후 mRNA를 세포질로 이동시키며 RNA Splicing이 마무리가 된다.