재조합 단백질 생산 및 배양법

재조합 단백질을 선택하기 위해선 다음과 같은 연구가 필요하다.

Discovery	유전자, 단백질의 역할 규명(약리학적 특성 규명)
전임상	약효, 독성, 약동력학적 특성을 연구하며, 공정연구가 선행되어야 하기 때문에 시료가 많이 필요함
임상 1상	건강한 20 ~ 80명에 대해 안전성과 약동력적 성질을 연구하며 2 ~ 3가지 용량으로 투여함
임상 2상	100 ~ 300명으로 약효와 부작용을 연구하며 투여 용량을 결정함
임상 3상	1000 ~ 5000명으로 장기적 약효, 부작용을 확인하고 2상에서 1 ~ 2가지의 용량을 확인하고 신약 허가를 신청함

재조합 단백질을 위한 생산 세포주를 선정하는 것으로는 크게 3가지가 있다.

박테리아는 성장 속도가 빠르고, 저렴하며, E.Coli가 purification Tag로 히스톤 단백질 6개를 N-Terminal에 붙이고 나오기 때문에 니켈을 사용하여 정제가 쉽다. 하지만, Posttranslational modification이 불가능하기 때문에 Glycosylation이 안된 재조합 단백질만 가능하다.

이스트는 특징으로 세포내 발현이 가능하고 배지 분비 발현이 가능하고, 또한 Posttranslational modification이 가능하다.

동물세포(보통 chinese hamster ovary (cho) cell line)는 3차구조가 완벽한 천연형 단백질 발현이 가능하고, Posttranslational modification이 가능하기 때문에 EPO(유전자 재조합 의약품)에 바로 사용이 가능하며 항체 치료제에 적합하다.

하지만, 배지 비용이 높으며, 이에 대해 실패시 꽤나 리스크가 크고, 성장속도도 느리며 세포 농도가 낮아서 생산성이 다른 세포주에 비해 낮은 점이 있지만, 인간을 위해 복잡한 3차구조를 가지는 재조합 단백질을 사용하기 위해서는 어쩔 수 없이 Cell line을 동물세포로 사용하는 수 밖에 없다.

만약에 목적 단백질 유전자(DNA Seq)를 확보했다면, gDNA에서, mRNA, cDNA을 통해 Intron을 제거하고 잘발현되는 코돈으로 변경시키는 codon optimization을 한다.

그 후, Cell Banking으로 Master Cell Bank(MCB)를 100개 제작하며 2개 이상을 다른 곳에 보관한다.(만약 배양 실패 시 큰 리스크를 그나마 덜 수 있음, 보험형식으로)

그후, MCB 1개마다 Working Cell Bank(WCB)를 100개 제작하고, MCB 마다 Research용으로 1개씩 제작한다.

그 후, Cell Bank 마다의 Identity, Purity, Suitability(동등성, 순도, 안정성(박테리오 파지의 유무))를 확인한다.

배양법은 다음과 같다.

회분식(Batch Culture)는 조작이 간편하고 오염도가 낮지만, 세포 농도가 낮으며 효율이 떨어져 단위 부피 생산성이 떨어진다.

유기식(Fed Batch Culture 혹은 continuous culture)는 고농도 세포가 가능하지만, 계속적으로 세포에게 영양분을 주입하기 때문에 오염성이 비교적 높으며 조절이 어렵다.

배지교환식(perfusion cell culture)은 고농도 세포를 만들 수 있고 휴지기간이 짧아 생산성이 높지만, 오염도가 마찬가지로 높으며 조작이 어렵고 세포 막힘 현상이 발생할 수 있다.

이러한 배양법을 사용하여 Viable Cells, Viability(80 ~ 85% 이상), Productivity를 확인한다.

정제방법으로는 Harvest 후, ppt(가라앉히기) 혹은 Sup(배지 사용하기, 바이러스 불멸화 제거 공정 포함)로 나뉘며 ppt의 경우 Cell Down 후 Purification을 진행하며 sup의 경우 purification으로 진행된다.

이에 대해 주의점으로는 산화제, pH, 온도, 교반 속도, 분해 효소에 대해 주의해야 한다.

참고로 A라는 가상의 단백분해효소가 있다하자, 이를 막기 위한 A 단백분해효소 저해제를 사용하게 된다면, 저해제도 제거해야함으로 공정이 추가된다.

이후, Procedure, Volume, Protein 농도, Total Protein, gE Ag 농도, Total gE농도, Specific Activity, Yield, Purification Fold를 이론값과 비교한다.

그 후, 특성 분리로는 3가지 분리법이 있다.

Size에 관한 Gel filtration은 큰 것(무거운 것)이 빨리 떨어지는 것을 이용하여 분리하는 방법이고,

Charge에 관한 Ion exchange는 농도차로 Cation +, Anion -로 분류하고 천천히 나오는 것을 Buffer로 처리하는 방법이다.

마지막으로 Specificity Binding Affinity는 항체 치료제에 대해 주로 사용되는 것으로 항체가 특이적으로 붙는지 여부를 확인하는 것이다.

이렇게 불순물들인 Host DNA, Host Cell Protien 등을 제거하며 추가적인 특성 연구로 Appearance(색과 투명도), Identity(Seq, 무게로 당질화에 따라 달라지는 것)을 안정성 시험과 품질 규격 확인한다.